Исследователи из Университета Райс (https://www.rice.edu/) разработали новый метод использования 3D-печати для создания искусственных сосудистых сетей из сахарной пудры.
Заменив традиционные методы производства 3D-печатью с помощью селективного лазерного спекания (SLS), команда создала экспериментальные шаблоны, изготовленные из спеченных лазером углеводных порошков. Эти конструкции на основе сахара позволяют создавать гидрогели, заполненные клетками, с помощью дендритных сосудистых сетей без использования вспомогательных материалов. Недавно разработанная технология может улучшить скорость и масштаб производства биоматериалов.
«Одним из самых больших препятствий на пути разработки клинически значимых тканей является заполнение большой структуры ткани сотнями миллионов живых клеток», - сказал Ян Кинстлингер (Ian Kinstlinger), ведущий автор и аспирант в инженерии школе Браун. «Выборочное лазерное спекание дает нам гораздо больший контроль во всех трех измерениях, позволяя нам легко получать доступ к сложным топологиям, сохраняя при этом полезность сахарного материала».
«ОСНОВНАЯ ВЫГОДА ЭТОГО ПОДХОДА - СКОРОСТЬ, НА КОТОРОЙ МЫ МОЖЕМ СОЗДАТЬ КАЖДУЮ СТРУКТУРУ ТКАНИ. МЫ МОЖЕМ СОЗДАТЬ НЕКОТОРЫЕ ИЗ КРУПНЕЙШИХ МОДЕЛЕЙ ТКАНИ, КОГДА-ЛИБО СОЗДАННЫХ ЗА ПЯТЬ МИНУТ ».
Метаболическая функция в тканях человека поддерживается доставкой кислорода и питательных веществ, а также удалением отходов через сложные трехмерные сети кровеносных сосудов. Понимание сосудистых систем имело важное значение для ученых при создании многоклеточных организмов, и их воспроизведение одинаково важно для создания тканей с помощью 3D-печати. По мнению исследовательской группы, эти ткани должны поддерживаться с использованием биосовместимых матриц, чтобы выжить и поставлять необходимые питательные вещества хозяину ткани.
В предыдущих исследованиях использовались методы мягкой литографии и формования игл, используемые для создания этих матриц, но достижения в области 3D-печати привели к более широкому внедрению таких методов, как прямая экструзия и струйные полимеры. В других исследованиях использовался свет для создания сложных микроканальных структур, но в качестве доминирующего и наиболее широко используемого метода явился «жертвенный шаблон».
Методика шаблонирования включает создание временного жертвенного желатина в форме желаемой сосудистой сети, в которую заключены клетки, которые затем выборочно удаляются. В то время как методы 3D-печати на основе экструзии привели к более широкому внедрению этого метода, возможности и сложность жертвенно-шаблонных сетей оставались ограниченными. «Существуют определенные конструкции, такие как нависающие структуры, разветвленные сети и мультисосудистые сети, которые вы действительно не можете сделать с помощью экструзионной печати», - объяснил Джордан Миллер (Jordan Miller), соавтор исследования и доцент кафедры биоинженерии в Райс.
В результате сосудистые системы, напечатанные с использованием методов экструзии, часто подвергаются деформации или разрушению под действием собственного веса, а их вязкость и поверхностное натяжение затрудняют точное дозирование небольших объемов. Кроме того, печать клеток с материалами поддержки может смягчить эти проблемы, но за счет более длительного времени печати и дополнительных этапов последующей обработки, которые становятся все более трудными с увеличением сложности сосудистой системы.
Тем временем SLS 3D-печать использует полностью поддерживаемый объем сборки на основе порошка, что позволяет изготавливать объекты со сложными выступами и неподдерживаемой геометрией. «Селективное лазерное спекание дает нам намного больший контроль во всех трех измерениях, позволяя нам легко получать доступ к сложным топологиям, сохраняя при этом полезность сахарного материала», - добавил Миллер.
Исследовательская группа выдвинула гипотезу о том, что использование 3D-печати SLS для производства жертвенных материалов вместо методов экструзии может позволить легко структурировать сосудистые сети в гидрогелях в присутствии хрупких человеческих клеток. Создавая разветвленные сети углеводных нитей с помощью SLS и применяя их для формирования объемных сосудистых сетей, команда стремилась создать более быстрый и более стабильный процесс биопечати.
Было обнаружено, что изомальт, сахарно-спиртовый раствор, обычно используемый в пастилках без сахара, совместим с SLS, и команда разработала рабочий процесс для автоматического изготовления трехмерных структур из изомальтового порошка. Хотя можно было спекать один слой чистого изомальта, сильная когезия порошка и относительно плохая сыпучесть делали его плохо подходящим для распределения по необходимости в гладкие, тонкие слои. Было обнаружено, что дальнейшее смешивание порошка с кукурузным крахмалом эффективно увеличивает поток порошка, сохраняя при этом качество спекания. Используя эту смесь, исследовательская группа успешно изготовила конструкции с трехмерным ветвлением и неподдерживаемой геометрией.
Начиная с структуры простой разветвленной архитектуры, исследователи продолжили наносить серию эластомеров, жестких пластиков и гидрогелей вокруг углеводов, подвергнутых последующей обработке. Во время процесса гидрогель становился полутвердым в течение нескольких минут, и исходный шаблон затем «умерщвляли», растворяя в забуференном водой или фосфатном солевом растворе (PBS). В каждом случае перфузия через узорчатую канальную сеть демонстрировала проходимость канала и возможность соединения разветвленных нитей. Несмотря на непрозрачность спеченных углеводов, полиэтиленгликоль и диакрилатные гели были успешно полимеризованы падающим светом под разными углами, демонстрируя успешность методологии команды.
Для подготовки 3D-моделей были использованы недавнол разработанная версия аппаратного и микропрограммного обеспечения OpenSLS подготовки 3D-моделей SLS, оптимизация процесса для углеводных SLS и обновленный программный инструментарий. Управляя возможностями мультиэкструдера программного обеспечения для нарезки с открытым исходным кодом, предназначенного для экструзионных 3D-принтеров, команда смогла закодировать определенные параметры спекания, что позволило им точно настроить окончательную геометрию модели.
Работая с учеными из Университета Вашингтона, чья исследовательская группа специализируется на изучении деликатных клеток, группа позже продемонстрировала посев эндотелиальных клеток в клетки печени грызунов, называемые гепатоцитами. «Мы показали, что перфузия через 3D сосудистые сети позволяет нам поддерживать эти большие ткани, похожие на печень», - сказал Миллер. «Несмотря на то, что по-прежнему существуют давние проблемы, связанные с поддержанием функции гепатоцитов, способность генерировать большие объемы ткани и поддерживать клетки в этих объемах в течение времени, достаточного для оценки их функции, является значительным шагом вперед».
Новая методология команды Райс позволила им преодолеть недостатки предыдущих методов 3D-печати и создать сложные жидкостные сети внутри искусственных живых тканей. Более того, хотя методика OpenSLS исследователей позволила им эффективно создавать углеводы диаметром до 300 мкм, оптические компоненты более высокого качества в коммерческих принтерах SLS все же могут давать шаблоны с более высоким разрешением. Это открывает возможность для дальнейших обновлений для процесса. Тем не менее, быстрый характер производственного процесса, при котором ни один из экспериментов не занимал более 15 минут, еще не позволил бы использовать этот процесс в различных областях биопечати.
«Этот метод может использоваться с гораздо более широким спектром смесей материалов, чем многие другие технологии биопечати», - добавила Келли Стивенс (Kelly Stevens), соавтор исследования и биоинженер из Вашингтонского университета. «Это делает его невероятно универсальным».
В последние годы компании и исследователи разработали целый ряд технологий аддитивного производства с целью создания сосудисто-подобных структур. Например, исследователи из Ноттингемского университета и Лондонского университета королевы Марии содали 3D-распечатанный оксид графена с белком, который может образовывать структуры, которые имитируют сосудистые ткани.
Ученые инженерного колледжа Бостонского университета, с другой стороны, разработали новый метод лечения ишемии путем 3D-печати сосудистого пластыря, который стимулирует рост кровеносных сосудов. Пластыри были протестированы на грызунах и оказались способными переносить питательные вещества по всему телу.
Между тем, шведский производитель CELLINK и базирующаяся в Техасе биотехнологическая компания Volumetric представили 3D-принтер, предназначенный для производства крупных сосудистых структур. Биопринтер Lumen X Digital Light Processing (DLP) работает с биочернилами для печати макропористых и сосудистых структур высокого разрешения.
Выводы исследователей подробно изложены в статье под названием «Создание модельных тканей с дендритными сосудистыми сетями с помощью шаблонов жертвенно-спеченных углеводов» (https://www.nature.com/articles/s41551-020-0566-1), опубликованной в журнале Nature Biomedical Engineering (https://www.nature.com/natbiomedeng/) 29 июня 2020 года.